將由細胞之中抽出的 mRNA，以隨機引子或是含有 oligo(dT) 的引子進行 RT-PCR，再用適當的限制酵素切割，進行選殖。對已得到的各個菌株加以整理，以有系統的方式，對每一個菌株的插入片段，進行單一次自動化定序 (single-pass automatic sequencing)，所得到序列即被稱為表現序列標幟。因為只進行單向與單一次的定序，並未經過再一次的確認，而且一些無法由機器自動判斷的區域，可能也未以人工的方式予以校正，因此這種序列的特徵之一，就是含有不少的錯誤，比如說可能會含有不少鹼基的插入、刪除、以及不明確性，而且這種現象在愈接序列資料的 3’端愈明顯，因此在做序列比對時必須慎選程式使用。

表現序列標幟 (Expressed sequence tag, EST)

圖1 EST序列的產生